BIFE

Δημιουργία Τράπεζας και Βάσης Δεδομένων φυσικών στελεχών μυκήτων με βιοτεχνολογική σημασία από την Ήπειρο

(Ακρώνυμο έργου: BIFE)

Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας, Τμήμα Βιολογικών Εφαρμογών και Τεχνολογίας, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων

Επιστημονικά Υπεύθυνος Καθηγητής Χαράλαμπος Σταμάτης

Επιστημονικός συνεργάτης Δε. Όλγα Κωστούλα

ΧΡΗΜΑΤΟΔΟΤΗΣΗ: Περιφέρεια Ηπείρου

A. ΕΙΣΑΓΩΓΗ

Πράσινη Βιοτεχνολογία και Τράπεζες μικροβιακών στελεχών: Η βιβλιογραφία και η έρευνα αγοράς σήμερα δείχνει ότι υπάρχει έντονη τάση και επιτακτική ανάγκη για παραγωγή νέων τοπικών ανταγωνιστικών προϊόντων με υψηλή προστιθέμενη αξία. Σε αυτή την κατεύθυνση εντάσσεται και η παραγωγή

α) προϊόντων που εντάσσονται στην κατηγορία των βιολογικών/βιώσιμων προϊόντων και

β) πρακτικών πράσινης βιοτεχνολογίας που γίνονται με τη χρήση μικροοργανισμών.

Τα προϊόντα και οι πρακτικές που προστατεύουν το περιβάλλον και τους καταναλωτές, έχουν αυξημένη, ζήτηση όχι μόνο στην Ευρώπη αλλά και στις διεθνείς αγορές.Βιοεφαρμογές που χρησιμοποιούν επιλεγμένους μικροοργανισμούς εξαρτώνται άμεσα από την προσφορά αυθεντικών και βιώσιμων μικροβιακών καλλιεργειών, γι’ αυτό το λόγο οι συλλογές μικροοργανισμών εξελίσσονται σε μεγάλη ανάγκη.

Τράπεζες μυκήτων: Οι μύκητες απαντώνται σε πολλά οικοσυστήματα παίζοντας σημαντικό ρόλο όχι μόνο στην ισορροπία και στην εξέλιξή τους. Αποτελούν μια μεγάλη ομάδα μικροοργανισμών με δυναμικό ανάπτυξης και επιβίωσης σε ευρύ φάσμα περιβαλλοντικών και ανθρώπινων οικοσυστημάτων, εξαιτίας των ανταγωνιστικών και ειδικών χαρακτηριστικών που αυτοί διαθέτουν. Ειδικά οι άγριες ζύμες (wild yeasts) είναι κύρια κινητήρια δύναμη πίσω από πολλές σύγχρονες βιομηχανικές βιοτεχνολογίες. Οι εφαρμογές επιλεγμένων μυκήτων σε τομείς όπως τρόφιμα, βιολογική γεωργία/κτηνοτροφία, ιχθυοκαλλιέργεια, φαρμακολογία-κοσμετολογία, διαιτολογία, αποκατάσταση περιβάλλοντος) αυξάνονται συνεχώς. Επομένως η ζήτησή τους στην αγορά, παρέχει ισχυρά κίνητρα για την αύξηση της έρευνας στον τομέα αυτό. Οι Τράπεζες μυκήτων έχουν αποδείξει πολλαπλώς τη μεγάλη αξία τους ως αποθήκες διατήρησης σημαντικών μικροβιακών ομάδων.

Τα πλεονεκτήματα των αυτόχθονων στελεχών: Συλλογές με αυτόχθονα μικροβιακά στελέχη χρησιμοποιούνται σε βιοεφαρμογές σε αρκετές χώρες, με στόχο την παραγωγή βιώσιμων προϊόντων με αυθεντικότητα και χαρακτήρα σε σχέση με την περιοχή παραγωγής τους. Τα φυσικά στελέχη έχουν πολλαπλά πλεονεκτήματα και η συμβολή τους στο να διατηρηθεί η αυθεντικότητα – τυπικότητα των προϊόντων είναι μεγάλη. Μια παρενέργεια της ευρείας χρήσης των εμπορικών καλλιεργειών εκκίνησης είναι η εξάλειψη της φυσικής μικροχλωρίδας, η οποία συχνά να οδηγεί σε προϊόντα με παρόμοιες αναλυτικές-αισθητικές ιδιότητες, χωρίς μεταβλητότητα και πολυπλοκότητα.Η χρήση καλλιεργειών τοπικής επιλογής υπερασπίζεται την πολιτική του “terroir” και της τυπικότητας (typicity). Οι παραγωγοί ενδιαφέρονται πολύ να έχουν τα δικά τους «άγρια» στελέχη γιατί δεν υπάρχουν μεμονωμένοι μικροοργανισμοί ή και ομάδες τους που να είναι ΚΑΘΟΛΙΚΑ ΚΑΤΑΛΛΗΛΟΙ ΚΑΙ ΕΦΑΡΜΟΣΙΜΟΙ. Ιδιότητες των φυσικών στελεχών που τα καθιστούν εξαιρετική επιλογή για βιοεφαρμογές είναι η καλή φαινοτυπική προσαρμογή, το πλούσιο βιοχημικό προφιλ, η γενετική σταθερότητα καθως και η εξειδικευμένη αναστολή έναντι μικροβίων.

B. ΣΗΜΑΣΙΑ ΚΑΙ ΠΡΟΟΠΤΙΚΕΣ ΤΗΣ ΤΡΑΠΕΖΑΣ ΚΑΙ ΒΑΣΗΣ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΓΗΓΕΝΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ ΗΠΕΙΡΟΥ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΟΥ ΕΝΔΙΑΦΕΡΟΝΤΟΣ

Στα πλαίσια υλοποίησης του ερευνητικού έργουμε τίτλο:«Δημιουργία Τράπεζας και Βάσης Δεδομένων φυσικών στελεχών μυκήτων με βιοτεχνολογική σημασία από την Ήπειρο» (Ακρώνυμο έργου: BIFE)δημιουργήθηκαν η Τράπεζας αυτόχθονων στελεχών μυκήτων με βιοτεχνολογική σημασία μυκήτων Ηπείρου (ΤΜΗ) η οποία συνοδεύεται από την Βάση Δεδομένων (ΒΔΜΗ), που ήταν οι βασικοί στόχοι του έργου BIFE.Το έργο επικεντρώθηκε στη δημιουργία μίας σημαντικού μεγέθους συλλογής φυσικών (αγρίου τύπου) στελεχών μυκήτων Ηπείρου με μελετημένες ειδικές φαινοτυπικές ιδιότητες βιοτεχνολογικής ή και βιολογικής σημασίας. Οι μύκητες επιλογής της ΤΜΗ προήλθαν από παραδοσιακά προϊόντα αγροδιατροφής και χώρους παραγωγής αυτών καθώς και από στοχευμένες οικοθέσεις μικροοργανισμών περιοχών της Ηπείρου. Η ΒΔΜΗ η οποία συνοδεύει την συλλογή στελεχών ΤΜΗ, είναι ένα ηλεκτρονικό αρχείο με καταγραφές γενικών και ειδικών φαινοτυπικών χαρακτηριστικών των στελεχών μυκήτων της συλλογής ΤΜΗ.

Καινοτομία -Συμβολή -Εφαρμογές των ΤΜΗ ΚΑΙ ΒΔΜΗ: Η ΤΜΗ συνοδευόμενη από την ΒΔΜΗ στοχεύει στην ανάπτυξη εφαρμογών πράσινης τεχνολογίας. Μέσω της δωρεάς, ανταλλαγής και αγοράς των στελεχών της ΤΜΗ, θα ενισχυθεί η τοπική παραγωγή τροφίμων- φυσικών προϊόντων με βιώσιμες πρακτικές της και η οικολογική διαχείριση του περιβάλλοντος περιοχών Ηπείρου. Ειδικά στον τομέα τροφίμων, επειδή η παραγωγή της θα στηρίζεται στη χρήση κυρίως αυτόχθονων λειτουργικών μικροοργανισμών, θα προστατεύεται η αυθεντικότητα και ο τοπικός χαρακτήρας της.Η ύπαρξη μιας Τράπεζας «τοπικών στελεχών επιλογής», δίνει τη δυνατότητας αποφυγής εισαγόμενων τυποποιημένων μικροβιακών στελεχών για την παραγωγή τροφίμων- βιοτεχνολογικές εφαρμογές. Αυτό θα έχει μακροπρόθεσμα ως αποτέλεσμα τη μείωση του κόστους και την αντιμετώπιση του τεχνολογικού συντηρητισμού στα τοπικά ηπειρωτικά προϊόντατης.Θα υπάρξει μεταφοράς τεχνογνωσίας από το Πανεπιστήμιο προς τις τοπικές επιχειρήσεις. Η διαχείριση της συλλογής ΤΜΗ θα επιτρέψει στην ακαδημαϊκή κοινότητα του Παν/μίου Ιωαννίνων να αποκτήσει επιστημονικά οφέλη, μέσω της ι) διεξαγωγής δημοσιεύσιμης έρευνας με οικολογική σημασία και ιι) εκμετάλλευσης των στελεχών και διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας που θα αφορούν αυτά. Τέλος η δημιουργία της ΤΜΗ αποτελεί σημαντική συμβολή στην α) διατήρηση της βιοποικιλότητας μικροχλωρίδας Ηπείρου και β) προσπάθεια της χώρας διεθνώς, να διατηρηθεί η φυσική κληρονομιά (natural heritage).

Στην Ελλάδα σήμερα υπάρχουν επισήμως λίγες συλλογές μικροοργανισμών απομονωμένων από τον Ελλαδικό χώρο, ( αυτόχθονα στελέχη), εκ των οποίων μόνο τρεις αποτελούν συλλογές αποκλειστικά μυκήτων (μυκητοθήκες). Οι υπάρχουσες αυτές μυκητοθήκες εστιάζουν το ενδιαφέρον και τις υπηρεσίες τους περισσότερο στη συστηματική ταξινόμηση στελεχών ή σε συλλογή παθογόνων στελεχών για τον άνθρωπο/φυτά/ ζώα και λιγότερο στη διερεύνηση φαινοτυπικών ιδιοτήτων για στοχευμένες βιοεφαρμογές. Στην Ήπειρο συγκεκριμένα, δεν υπάρχει επίσημη συλλογή αυτόχθονων μυκήτων με βιοτεχνολογική ή και βιολογική σημασία, οι δε ανάλογες επιστημονικές αναφορές σπανίζουν έως και απουσιάζουν.

Συνέχεια του έργου BIFE: Η δημιουργία της ΤΜΗ -ΒΔΜΗ είναι η βάση για τη ολοκλήρωση στο μέλλον μιας συλλογής μεγαλύτερου αριθμού φυσικών τυποποιημένων στελεχών μυκήτων με φαινοτυπικά χαρακτηριστικά ποικίλου ενδιαφέροντος, η οποία θα εδράζεται σε ένα οργανωμένο χώρο του Πανεπιστημίου και επανδρωμένο με επιστήμονες με σκοπό να προσφέρει της υπηρεσίες της προς όφελος της Ηπείρου και της Επιστήμης.

Γ. ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟ ΑΡΧΕΙΟ – ΒΑΣΗ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ ΤΗΣ ΤΡΑΠΕΖΑΣ ΓΗΓΕΝΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ ΗΠΕΙΡΟΥ ΜΕ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΚΗ ΣΗΜΑΣΙΑ (ΒΔΜΗ)

Τράπεζα γηγενών μυκήτων Ηπείρου με βιοτεχνολογική σημασία (ΤΜΗ)

Η Τράπεζα Μυκήτων Ηπείρου (ΤΜΗ) του έργου BIFE είναι κωδικοποιημένα συντηρημένα γηγενή στελέχη ζυμομυκήτων Ηπείρουκαιεδράζεται στο Βιοτεχνολογικό Εργαστήριο του Τμήματος Βιοτεχνολογικών Εφαρμογών και Τεχνολογιών (ΒΕΤ), Παν/μιου Ιωαννίνων, υπό την ευθύνη του Καθηγητή Χαράλαμπου Σταμάτη και Επιστημονικού Υπεύθυνου του έργου BIFE. Η συλλογή αποτελείται από συνολικά 60 επιλεγμένα στελέχη μυκήτων με φαινοτυπικά χαρακτηριστικά βιοτεχνολογικούενδιαφέροντος.Οι μύκητες προέρχονται από φυσικά υποστρώματα όπως άνθη γηγενών αρωματικών φυτών, άγρια φρούτα, φυλλική επιφάνεια και καρποί φυτών βιολογικών καλλιεργειών καθώς και από ποτά και τρόφιμα φυσικής ζύμωσης που παρασκευάζονται με παραδοσιακή τεχνική. Τα στελέχη ΤΜΗ απομονώθηκαν από ξηροφυτικές παραθαλάσσιες περιοχές και από καλλιέργειες φυσικής λίπανσης ή καθόλου λίπανσης του Νομού Πρεβέζης, από παραλίμνιες, πεδινές και ορεινές περιοχές (υψόμετρο 740-760 μέτρα) του Νομού Ιωαννίνων και παραδοσιακά τρόφιμα παραγωγής περιοχών των Νομών Ιωαννίνων καιΘεσπρωτίας.

Κάθε στέλεχος συντηρείται α) σε μορφή εναιωρήματος γλυκερόλης σε συνθήκες κατάψυξης (εικόνα 1,2) και β) σε μορφή στερεής καλλιέργειας (εικόνα 3) σε συνθήκες ψυγείου και φέρει ειδικό κωδικό με το πρόθεμα BF (Biotechnological Fungi). Ταυτοποιητικά τα μελετηθέντα στελέχη ανήκουν σε είδη ζυμομυκήτων ή ζυμών (yeasts) και σε είδη μυκήτων που προσομοιάζουν με ζύμες (yeast-like fungi) με φαινοτυπικά χαρακτηριστικά που η Βιοτεχνολογία εδώ και χρόνια έχει στραμμένο έντονα το ενδιαφέρον της. Δηλαδή η συλλογή περιλαμβάνει στελέχη μυκήτων στα οποία ανιχνεύθηκαν φαινότυποι με βιοτεχνολογική σημασία αλλά και με δυναμικό βιοτεχνολογικών μελετών.

Εικόνα 1

Εικόνα 2

Εικόνα 3.

Βάση Δεδομένων της Τράπεζας γηγενών μυκήτων Ηπείρου με βιοτεχνολογική σημασία (ΒΔΜΗ)

Η Βάση Δεδομένων της Τράπεζας γηγενών Μυκήτων Ηπείρου με βιοτεχνολογική σημασία (ΒΔΜΗ) συνοδεύει την ΤΜΗ και είναι ένα ηλεκτρονικό αρχείο με καταγραφές συνολικά 65 γενικών και ειδικών φαινοτυπικών χαρακτηριστικών των μυκήτων της συλλογής ΤΜΗ. Από το σύνολο καλλιεργήσιμων (culturable) γηγενών («αγρίου τύπου»- wild type) μυκήτων Ηπείρου που απομονώθηκαν κατά τη διάρκεια του έργου BIFE, επιλέχθηκαν στελέχη για τη μελέτη συνόλου φαινοτυπικών χαρακτηριστικών με βιοτεχνολογική σημασία. Ο συνδυασμός των μελετηθέντων φαινοτυπικών χαρακτηριστικών ανά στέλεχος ΤΜΗ, επιλέχθηκε ανάλογα με α) το είδος που ανήκει και β) το υπόστρωμα απομόνωσής του. Εκτός των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών των στελεχών που αναφέρονται στη ΒΔΜΗ, δίνονται πληροφορίες για το υπόστρωμα απομόνωσης στελέχους, την περιοχή και τη χρονική περίοδο συλλογής δειγμάτων από τα οποία απομονώθηκαν οι μύκητες. Οι αναφορές φαινοτυπικών χαρακτηριστικών στη ΒΔΜΗ γίνονται ανά κωδικοποιημένο στέλεχος ζυμομύκητα ΤΜΗ. Τα μυκητιακά στελέχη ταυτοποιήθηκαν με βάση ειδικά φαινοτυπικά χαρακτηριστικά με ταξινομική και μεταβολική σημασία (φαινοτυπικός χαρακτηρισμός) για ζύμες (yeasts) και μύκητες που προσομοιάζουν με ζύμες (yeastlike fungi). Η ταυτοποίηση μυκήτων σε επίπεδο είδους βασίσθηκε σε:

Α) Μακροσκοπικά και μικροσκοπικά χαρακτηριστικά (π.χ. μορφολογία αποικίας, κυτταρική μορφολογία, τρόπος αγενούς και εγγενούς πολλαπλασιασμού, μορφή υφών) και σύμφωνα με ειδικές ταξινομικές κλείδες και

Β) Ανίχνευση ικανότητας ανάπτυξης σε υποστρώματα με διαφορετική πηγή υδατάνθρακα (υδατανθρακικά υποστρώματα-carbohydrate substrates).

Τα ταυτοποιημένα μυκητιακά στελέχη της ΤΜΗ συλλογής ανήκουν σε είδη των γενών:

- Aureobasidium
- Candida,
- Debaryomyces
- Geotrichum
- Metscknikowia
- Meyerozyma,
- Pichia
- Rhodorotula
- Saccharomyces
- Schwaniomyces
- Trichosporon

Η ΒΔΜΗ περιλαμβάνει τα ακόλουθα έξι (6) κεφάλαια (Ι-VI):

Ι. ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΚΩΔΙΚΩΝ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΜΕΝΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ ΤΜΗ

ΙΙ ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ ΑΝΙΧΕΥΣΗΣ ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ ΤΜΗ

ΙΙΙ. ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΝΑ ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΜΥΚΗΤΑ ΣΥΛΛΟΓΗΣ ΤΜΗ

IV. IKANOTHTA ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΦΥΣΙΚΗΣ ΔΙΑΧΕΟΜΕΝΗΣ ΜΥΚΟΤΟΞΙΝΗΣ – ΕΝΕΡΓΟΤΗΤΑ ΥΠΟ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΘΕΡΜΟΚΡΑΣΙΑΣ

V. ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΣΕ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑ ΜΕ ΦΥΣΙΚΟ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑ ΟΙΝΟΛΑΣΠΗΣ

VI. ΒΙΩΣΙΜΟΤΗΤΑ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΤΡΑΠΕΖΑΣ ΣΤΕΛΕΧΩΝ ΥΠΟ ΚΡΥΟΣΥΝΤΗΡΗΣΗ

ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ ΑΝΙΧΕΥΣΗΣ ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΩΝ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΩΝ ΜΥΚΗΤΩΝ ΤΜΗ

Ανίχνευση ικανότητας οξειδωτικού μεταβολισμού 30 πηγών υδατανθράκων (carbohydrate substrates).

Επιλεγμένα στελέχη εξετάσθηκαν ως προς την ικανότητα να μεταβολίζουν οξειδωτικά διαφορετικά υδατανθρακικά υποστρώματα (αξιολόγηση αυξανογράμματος). Τα υποστρώματα με τις πηγές υδατανθράκων είναι σε υγρή μορφή και περιέχουν μόνο μια πηγή άνθρακα. Οι χημικές ουσίες βάση των οποίων έγινε ο φαινοτυπικός χαρακτηρισμός (φαινοτυπική ταυτοποίηση) των στελεχών ανήκουν στις κατηγορίες των: μονοσακχαριτών, αμινομονοσακχαριτών δισακχαριτών τρισακχαριτών πολυολών, οργανικών οξέων και αλάτων αυτών.

Ικανότητας ανάπτυξης υπό διαφορετικές θερμοκρασίες

Επιλεγμένα στελέχη δοκιμάσθηκαν ως προς την ικανότητά τους να αναπτυχθούν σε στερεά υποστρώματα υπό διαφορετικές θερμοκρασίες για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα.

Ικανότητα ανάπτυξη στελεχών μυκήτων σε υπόστρωμα με διαφορετικό pH

Επιλεγμένα στελέχη δοκιμάσθηκαν ως προς την ικανότητά τους να αναπτυχθούν σε στερεά υποστρώματα με διαφορετικά pH (εύρος pH από όξινο έως βασικό) στους 25º C για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα.

Ικανότητας ανάπτυξης σε υπόστρωμα υψηλής συγκέντρωσης σακχάρου

Επιλεγμένα στελέχη δοκιμάσθηκαν ως προς την ικανότητά τους να αναπτυχθούν σε στερεά υποστρώματα υψηλής συγκέντρωσης γλυκόζης για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα.

Ικανότητα ανάπτυξης σε υπόστρωμα υψηλής αλατότητας

Επιλεγμένα στελέχη δοκιμάσθηκαν ως προς την ικανότητά τους να αναπτυχθούν σε στερεά υποστρώματα με υψηλή συγκέντρωση χλωριούχου νατρίου (NaCl) στους 25º C για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα επώασης

Ικανότητα μεταβολισμού φαινόλης ως μοναδική πηγή άνθρακα

Επιλεγμένα στελέχη δοκιμάσθηκαν ως προς την ικανότητά τους να αναπτυχθούν σε υγρό υπόστρωμα με μοναδική πηγή άνθρακα τη φαινόλη, στους 25º C για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα.

Παρουσία φυσικών χρωστικών στη μακρομορφολογία

Τα στελέχη αναπτύχθηκαν σε διαφορετικά στερεά /υγρά υποστρώματα σε διαφορετικές συνθήκες θερμοκρασίας και pH για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα για τον έλεγχο εμφάνισης χρωστικής στη μακρομορφολογία αποικίας ή διαχεόμενης χρωστικής στο στερεό υπόστρωμα ανάπτυξης στις αντίστοιχες συνθήκες ανάπτυξης. Στην περίπτωση ανάπτυξης σε υγρό υπόστρωμα ανιχνεύεται ο χρωματισμός του.

Αντοχή στην ακτιδιόνης (actidione) :

Τα στελέχη δοκιμάσθηκαν ως προς την ικανότητά τους να αναπτυχθούν σε υγρό υπόστρωμα ανάπτυξης (ως πηγή άνθρακα χρησιμοποιήθηκε η γλυκόζη) με διαφορετικές συγκεντρώσεις ακτιδιόνης σε θερμοκρασία επώασης 25ºC για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα.

Aντοχή στη χλωραμφερνικόλης (chloramphernicol):

Τα στελέχη δοκιμάσθηκαν ως προς την ικανότητά τους να αναπτυχθούν σε στερεό υπόστρωμα επιλεγμένης συγκέντρωσης χλωραμφερνικόληςσε θερμοκρασία 25º C για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα.

Αντοχή στο υποχλωριώδες νάτριο

Τα στελέχη μυκήτων εξετάσθηκαν ως προς την ικανότητά τους να αναπτύσσονται σε υγρό υπόστρωμα με διαφορετικές συγκεντρώσεις υποχλωριώδους νατρίου (NACLO) στους 25º C για συγκεκριμένο χρονικό διάστημα.

Αντοχή στη UV ακτινοβολία

Επιλεγμένα στελέχη δοκιμάσθηκαν ως προς την ικανότητά τους να αναπτυχθούν σε στερεό υπόστρωμα στους 25 ºC, μετά από έκθεσή τους σε UV ακτινοβολία για συγκεκριμένο χρόνο.

Ικανότητα παραγωγής β- γλυκοζιδάσης

Επιλεγμένα στελέχη δοκιμάσθηκαν ως προς την ικανότητά τους να παράγουν ενεργή βήτα- γλυκοζιδάση (beta-glucosidase). Ο ποιοτικός προσδιορισμός παραγωγής του ενζύμου από τα στελέχη βασίσθηκε σε χρωμογόνο υπόστρωμα με βάση την εσκουλίνη ( pH 6.4-6,8) σε θερμοκρασία 25º C.

Ικανότητα παραγωγής λιπάσης

Επιλεγμένα στελέχη δοκιμάσθηκαν ως προς την ικανότητά τους να παράγουν το επαγωγικό ένζυμο λιπάση και να διασπούν το Τween 80 (υδατοδιαλυτός εστέρας λιπαρών οξέων. Η δοκιμασία εγινε σε στερεό υπόστρωμα σε θερμοκρασία 25º C.

Ικανότητα παραγωγής χιτινάσης

Επιλεγμένα στελέχη δοκιμάσθηκαν ως προς την ικανότητά τους να παράγουν ενεργή χιτινάση και να διασπούν την κολλοειδή χιτίνη. Η δοκιμασία εγινε σε στερεό υπόστρωμα σε θερμοκρασία 25º C.

Ικανότητα παραγωγής φυσικής διαχεόμενης (diffusible) μυκοτοξίνης κατά μυκήτων αερογενών/ αλλοίωσης τροφίμων

Επiλεγμένα στελέχη δοκιμάσθηκαν ως προς την ικανότητά του να παράγουν φυσική διαχεόμενη μυκοτοξίνη τύπου φονέα (killer mycotoxin) κατά ζυμομυκήτων αερογενών είτε αλλοιογόνων τροφίμων. Ως πρότυπο ευαίσθητο στέλεχος χρησιμοποιήθηκε το Saccharomyces cerevisiae Davis 522 (K-R-) με χαρακτήρα ευαίσθητο σε μυκοτοξίνη φονέα (killer toxin). Θετικό αποτέλεσμα θεωρείται η εμφάνιση γύρω από το μυκοτοξινογόνο μύκητα ζώνης αναστολής ανάπτυξης του πρότυπου ευαίσθητου στελέχους είτε των εξεταζόμενων ως πιθανά ευαίσθητων στελεχών στην παραγόμενη μυκοτοξίνη.

Ικανότητα παραγωγής «killer” μυκοτοξίνης κατά μυκήτων ζύμωσης/ωρίμανσης τροφίμων:

Επιλεγμένα στελέχη δοκιμάσθηκαν ως προς την ικανότητα παραγωγής μυκοτοξίνης κατά μυκήτων ζύμωσης οίνου είτε ωρίμανσης τροφίμων. Ως πρότυπο ευαίσθητο στέλεχος χρησιμοποιήθηκε το Saccharomyces cerevisiae Davis 522 (K-R-) με χαρακτήρα ευαίσθητο σε μυκοτοξίνη φονέα (killer toxin). Η δοκιμασία έγινε σε στερεό υπόστρωμα ανάπτυξης. Θετικό αποτέλεσμα θεωρείται η εμφάνιση γύρω από το μυκοτοξινογόνο μύκητα ζώνης αναστολής ανάπτυξης των εξεταζόμενων ως πιθανά ευαίσθητων στελεχών στην παραγόμενη μυκοτοξίνη.

Ενεργότητα/σταθερότητα της παραγόμενης μυκοτοξίνης υπό διαφορετικές θερμοκρασίες

Στα μυκοτοξινογόνα στελέχη μυκήτων ανιχνεύθηκε η ενεργότητα της παραγόμενης μυκοτοξίνης υπό διαφορετικές θερμοκρασίες. Η δοκιμασία έγινε σε στερεό υπόστρωμα ανάπτυξης και θετικό αποτέλεσμα θεωρείται η εμφάνιση γύρω από το μυκοτοξινογόνο μύκητα μίας ζώνης αναστολής ανάπτυξης του πρότυπου ευαίσθητου στελέχους είτε των εξεταζόμενων ως πιθανά ευαίσθητων στελεχών στην παραγόμενη μυκοτοξίνη.

Ικανότητα ανάπτυξης σε υποστρώματα με φυσικό εκχύλισμα οινολάσπης

Επιλεγμένα στελέχη δοκιμάσθηκαν ως προς την ικανότητά τους να αναπτυχθούν σε στερεό υπόστρωμα με διαφορετικές συγκεντρώσεις εκχυλίσματος οινολάσπης (εκφρασμένες σε ισοδύναμα καφεϊκού οξέως Η οινολάσπη προέρχεται από φυσική ζύμωση γλεύκους που προέρχεται από σταφύλια γηγενούς ποικιλίας Ηπείρου βιολογικής καλλιέργειας. Θερμοκρασία επώασης είναι οι 25º C.

Βιωσιμότητα στελέχους σε κρυοσυντήρηση

Τα στελέχη της ΤΜΗ εξετάσθηκαν ως προς τη βιωσιμότητά τους σε συνθήκες κρυοσυντήρησης. Το κάθε στέλεχος πριν εξετασθεί ως προς τη βιωσιμότητά του, παρέμεινε για 12-24 μήνες στην κρυοσυντήρηση, συγκεκριμένα ως κυτταρικό εναιώρημα σε κρυοπροστατευτικό υδατικό δ/μα γλυκερόλης συγκέντρωσης 30% και 50% v/v αντίστοιχα, σε συνθήκες κατάψυξης.

Μεθοδολογία μελέτης φαινοτύπου στελεχών – Βιβλιογραφία

Η μεθοδολογία εξέτασης των φαινοτυπικών χαρακτηριστικών αναφέρεται αναλυτικά στο Τεχνικό Δελτίο έργου και στα Παραδοτέα ΠΕ2.1 (Ενότητα έργου ΕΕ2), ΠΕ3.1, ΠΕ3.2 (Ενότητα έργου ΕΕ3) που έχουν κατατεθεί. Η βιβλιογραφία έργου αναφέρεται αναλυτικά στα Παραδοτέα ΠΕ1.1 και ΠΕ1.2 (Ενότητα ΕΕ1), στο ΠΕ3.2 (Ενότητα ΕΕ3) καθώς και στο Παραδοτέο ΠΕ4.1 -Τελική Έκθεση Πεπραγμένων Έργου BIFE (Ενότητα ΕΕ4).

Πληροφόρηση για την ΤΜΗ – ΒΔΜΗ

Για οποιαδήποτε πληροφόρηση σχετικά με την ΤΜΗ – ΒΔΜΗ, απευθυνθείτε στο Εργαστήριο Βιοτεχνολογίας, Τμήμα ΒΕΤ του Παν/μιου Ιωαννίνων όπου οι υπεύθυνοι για την Τράπεζα μυκήτων επιστημονικοί συνεργάτες, θα σας παρέχουν τις απαραίτητες διευκρινίσεις για τα μυκητιακά στελέχη, τα ειδικά φαινοτυπικά χαρακτηριστικά τους καθώς και χρήσιμες πληροφορίες για το δυναμικό βιοτεχνολογικών εφαρμογών των στελεχών σε σχέση με τον φαινότυπό τους, με αναφορά σε σχετική βιβλιογραφία.

Καθηγητής Χαράλαμπος Σταμάτης e-mail: hstamati@uoi.gr

Δρ. Όλγα Κωστούλα e-mail: olkostul@hotmail.com